Poprzednia                                 Index                                 Następna

Odrobina teorii:

Punkt izoelektryczny (pI) to wartość pH w którym suma ładunków elektrostatycznych cząsteczki wynosi zero. W przypadku białek zależy ona głównie od siedmiu naładowanych aminokwasów: kwasu glutaminowego (grupa δ-karboksylowa), kwasu asparaginowego (grupa ß- karboksylowa), cysteiny (grupa tiolowa), tyrozyny (grupa fenolowa), histydyny (pierścień imidazolowy), lizyny (grupa ε-amidowa) i argininy (grupa guanidynowa). Ponadto wpływ mają także grupy NH₂ i COOH znajdujące się na końcach białka. Każda z nich charakteryzuje się inną wartością stałej dysocjacji pK. Ładunek elektryczny białka odnosi się do pH roztworu (bufor) w którym się ono znajduję w związku z czym ma ono także wpływ na obliczanie pI. Uwzględniając te wszystkie parametry i wykorzystując równanie Hendersona-Hasselbacha możemy wywnioskować następujące wzory pozwalające obliczyć ładunek cząsteczki w określonym pH buforu:

Jak widać z równań jedyną zmienną jest pH buforu. Zmieniając jego wartość możemy ustalić punkt izoelektryczny danego białka. Wyznaczenie tej wartości ma duże znaczenie w biochemii w technikach elektroforetycznych i ogniskowaniu izoelektrycznym, ponieważ umożliwia dobranie odpowiedniego środowiska.

Ogólnie w pH poniżej pI białka mają ładunek dodatni, zaś powyżej ich ładunek jest ujemny. Ma to duże znaczenie w czasie rozdziału metodą elektroforezy. pH żelu elektroforetycznego zależy od użytego buforu. Jeżeli pH buforu jest wyższe od pI białka, to będzie ono migrować w kierunku anody (ujemny ładunek jest przyciągany do niej). Z drugiej strony jeśli pH buforu jest niższe od pI białka będzie ono się poruszać w kierunku ujemnie naładowanej stronie żelu. Białko nie będzie migrować jeśli pH buforu i pI danego białka będą sobie równe.

Stosując powyższe wzory możemy obliczyć teoretyczny punkt izoelektryczny. Pisze teoretyczny, ponieważ wartość wyliczona będzie prawie na pewno odbiegać od zaobserwowanej z kilku względów. Po pierwsze samo założenie, że pI zależy jedynie od wartości pK wspomnianych wyżej aminokwasów jest raczej uproszczeniem. Nie bierzemy także pod uwagę modyfikacji białek, które mogą modyfikować ładunek białka (np. fosforylacja). Problematyczna jest także obecność cysteiny, ponieważ jeśli tworzy ona mostki siarczkowe to takich cystein nie należy brać pod uwagę przy obliczeniach. Pomimo tych wad można teoretycznie wyliczyć pI z dokładnością plus minus 0.5.
Krytycznym momentem  wyznaczania punktu izoelektrycznego jest użycie odpowiednich wartości pK. W tym przypadku mamy spory wybór. Poniżej przedstawiono przykładowe wartości według różnych źródeł:

Posiadając tych kilka wiadomości możemy się pokusić o napisanie prostego programu obliczającego punkt izoelektryczny. Program ten napiszemy w języku C++ korzystając z darmowego kompilatora DevC++. Czytanie dalszej części ma sens jedynie, gdy czytelnik posiada podstawową wiedzę z zakresu programowania w tym języku.